炭疽桿菌pagA cap rpoB基因檢測試劑盒(三重熒光PCR)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：炭疽桿菌 pagA、cap、rpoB 基因（BaP/C/R）檢測試劑盒(三重熒光 PCR 法) Name：Bacillus Anthracis pagA、cap、rpoB gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】

50T/盒

【預(yù)期用途】

炭疽是由炭疽桿菌（Bacillus Anthracis, BA）感染引起的一種人獸共患病。BA 在環(huán)境中形成芽孢，可長期、穩(wěn)定地存在于自然界中。由于 BA 的穩(wěn)定性及其致病性，易引發(fā)突發(fā)公共衛(wèi)生事件。目前的 BA 檢測方法主要基于病原體的培養(yǎng)、染色鏡檢、血清學(xué)檢測等，但這些方法均不適合早期的快速偵檢?；诤怂釞z測的熒光-PCR       技術(shù)，因其靈敏度高、操作簡單、特異性好，可快速檢測炭疽病原，及時控制炭疽疫情。

本試劑盒采用探針法實時熒光定量 PCR 技術(shù)，用于水皰內(nèi)容物、病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液、腦脊液以及增菌液中炭疽桿菌的定性檢測。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，對炭疽桿菌的 pagA、cap、rpoB 的基因分別設(shè)計特異性引物和特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對炭疽桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

炭疽水皰內(nèi)容物、炭疽病灶滲出物、分泌物、痰液、嘔吐物、糞便、血液、腦脊液等；

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸， 嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 200μL 于 1.5mL滅菌離心管中；咽拭子樣品直接取 200μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2  核酸提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明書進行操作。

2.  試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性質(zhì)控品+1 管陽性質(zhì)控品)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21μL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.  PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM，Cy5，TXR， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.  結(jié)果分析判定

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性質(zhì)控品)，重新分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

FAM 通道為 pagA 基因檢測結(jié)果，Cy5 通道為 cap 基因檢測結(jié)果，TXR 通道為 rpoB 檢測結(jié)果； 陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤38，且曲線有明顯的增長曲線， 判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

6.  質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 陽性質(zhì)控品、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，*混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。

【生產(chǎn)企業(yè)】

企業(yè)名稱：上海晅科生物科技有限公司